Home » Παρουσιάσεις

Εισαγωγή στην Πρωτεωμική (παλιό υλικό)

Submitted by on September 2, 2009 – 4:45 pmNo Comment
Εισαγωγή στην Πρωτεωμική (παλιό υλικό)

Το κείμενο το υπογράφει ο Νίκος Παρίσης, Υποψήφιος διδάκτορας Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, MSc Βιοτεχνολογίας, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων.

Το  γένωμα του βακτηριοφάγου MS2 με υϊκό RNA ήταν το πρώτο το οποίο αποκωδικοποιήθηκε πλήρως το 1976 (Fiers et al. 1976). Από τότε, αλλά ειδικά μετά το 1995, οι ακολουθίες DNA πολλών οργανισμών αποκωδικοποιήθηκαν όπως του Heamophilus influenzae, E. coli, Arabidopsis thaliana κ.α. τα οποία θεωρούνται βασικά εργαλεία στην έρευνα. Στις αρχές τις δεκαετίας του ’90 ξεκίνησε το Πρόγραμμα Αποκωδικοποίησης του Ανθρώπινου Γενώματος (Human Genome Project – HGP) στο οποίο εργάστηκαν ανεξάρτητα κυβερνητικοί και ιδιωτικοί φορείς (Celera Genomics) με σκοπό την αποκρυπτογράφηση του DNA του ανθρώπου. Από το 2001, όταν δημοσιεύτηκαν τα πρώτα αποτελέσματα, έως το 2003 όταν ολοκληρώθηκε το πρόγραμμα (λίστα με τις δημοσιεύσεις για κάθε χρωμόσωμα μπορείτε να βρείτε εδώ), ξεκίνησε η ανάλυση των αποτελεσμάτων η οποία συνεχίζεται μέχρι σήμερα και υπολογίζεται να συνεχιστεί για πολλά χρόνια ακόμη. Οι προσπάθειες αυτές αποκάλυψαν την ‘πληροφορία’ για την δημιουργία ενός ανθρώπινου οργανισμού. Ο αριθμός των γoνιδίων υπολογίστηκε περίπου στις 26.000, σύμφωνα με τους κυβερνητικούς φορείς, ή στις 31.000, σύμφωνα με την Celera, ενώ ο αριθμός αυξάνεται με το χρόνο. Σήμερα υπολογίζεται ότι ο αριθμός των γονιδίων φτάνει στα 38.612 (Genomes online database).

Είναι πολύ ενδιαφέρον η σύγκριση του αριθμού των γονιδίων του ανθρώπου με άλλους οργανισμούς, οι οποίοι διαφέρουν φαινοτυπικά σε τεράστιο βαθμό: 6.000 η ζύμη, 13.000 η μύγα, 18.000 το σκουλήκι, 26.000 τα φυτά. Για παράδειγμα, παρότι ο άνθρωπος αποτελείται από περίπου 1013 κύτταρα έχει περίπου μόνο τα διπλάσια γονίδια από το C. elegans, το οποίο αποτελείται από 959 κύτταρα. Συνεπώς, η διαφορά και η πολυπλοκότητα του ανθρώπινου οργανισμού με άλλους απλούστερους οργανισμούς δεν είναι απόρροια του αριθμού των γονιδίων και θα πρέπει να αποδοθεί σε άλλους μηχανισμούς πέρα από το DNA.

Γενικά, η μέθοδος εντοπισμού και πρόβλεψης γονιδίων στους πολυκύτταρους οργανισμούς δεν είναι πάντοτε ακριβής λόγω των περιορισμένων δυνατοτήτων των ab initio (υπολογιστικών) μεθόδων που χρησιμοποιούνται. Για αυτό, όλα τα γονίδια θα πρέπει να μελετηθούν πειραματικά ώστε να βρεθεί η λειτουργία κάθε γονιδίου (λειτουργικη γονιδιωματική – functional genomics). Η έρευνα έχει στραφεί στην μελέτη των συστημάτων που συμμετέχουν στην έκφραση των μακρομορίων που αποτελούν ένα βιολογικό σύστημα καθώς και στα ίδια τα μακρομόρια, π.χ. mRNA (μεταγραφομική, transcriptomics), πρωτεΐνες (πρωτεομική, proteomics), προϊόντα μεταβολισμού (μεταβολομική, metabolomics) (Εικόνα 1). Είναι προφανές ότι ένα γονίδιο μπορεί να παράγει περισσότερο από μια πρωτεΐνες ενώ η πολυπλοκότητα αυξάνεται ακόμη περισσότερο με την εναλλακτική συρραφή ή μάτισμα (alternative splicing) των RNA. Επίσης, οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις (post-translational modifications – PTM) μπορούν να αλλάξουν τη λειτουργία μιας πρωτεΐνης, ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό των πρωτεϊνών βρίσκεται σε σύμπλοκα με άλλες πρωτεΐνες, DNA ή RNA. Τέλος, η λειτουργία των πρωτεϊνών εξαρτάται και από την τοποθεσία που δρα μέσα στο κύτταρο (πυρήνα, κυτταρόπλασμα, κυτταρική μεμβράνη κτλ.). Παράλληλα, έχει αποδειχθεί ότι οι αλλαγές στα επίπεδα των mRNA δεν αντανακλώνται σε αυτά των πρωτεϊνών (Gygi et al. 1999). Αυτό οφείλεται στους πολυάριθμους μηχανισμούς που μεσολαβούν μέχρι να εμφανιστεί η πρωτεΐνη στη τελική μορφή.

Εικόνα 1. Η περιγραφή των ‘-omics’. Η γενωμική περιλαμβάνει την ολοκληρωμένη περιγραφή του γενετικού κώδικα ενός οργανισμού, ο οποίος μπορεί να χαρακτηριστεί ως το ‘πρόγραμμα δράσης’ του κυττάρου. Για την πλήρη περιγραφή ενός γονιδίου και της πρωτεΐνης που εκφράζει, είναι απαραίτητοι κλάδοι που μελετάνε: το σύνολο των mRNA (transcriptome), το σύνολο των πρωτεϊνών (proteome) και το σύνολο των μεταβολιτών (metabolome) που εκφράζονται/παράγονται από ένα γένωμα σε μια χρονική στιγμή. Επίσης, η μελέτη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μακρομορίων (interactome) είναι απαραίτητη για την δημιουργία ολοκληρωμένης εικόνας. (Μερική αναπαραγωγή και μετάφραση από Simpson, 2003)

ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ

Ο όρος ‘πρωτέωμα’ (proteome) εισήχθη το 1994 από έναν διδακτορικό φοιτητή, ο οποίος ήθελε να περιγράψει ‘το σύνολο των πρωτεϊνών που παράγεται από ένα γένωμα σε μια χρονική στιγμή’ (Wasinger et al. , 1995). Είναι σημαντικό να αναφέρεται και το ‘σε μια χρονική στιγμή’ καθώς, ενώ τα κύτταρα ενός οργανισμού περιέχουν πανομοιότυπο γένωμα, το σύνολο των πρωτεϊνών που εκφράζουν είναι διαφορετικός ανάλογα με τον ιστό και τη χρονική στιγμή που μελετάται. Συνεπώς, το γένωμα είναι ένα και μοναδικό και παράγει πολλά πρωτεώματα ανάλογα με τα ερεθίσματα που λαμβάνει το κύτταρο, τη θέση που βρίσκεται κτλ.

Η πρωτεωμική (Proteomics) μπορεί να χωριστεί στους παρακάτω τομείς, οι οποίοι όμως συμπληρώνουν ο ένας τον άλλον (ελεύθερη μετάφραση στα ελληνικά):

  • Αναλυτική πρωτεωμική (Proteomic analysis) – Η ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός πρωτεϊνών σε μεγάλη κλίμακα, μαζί με τις PTMs τους.
  • Συγκριτική πρωτεωμική (Expression proteomics ή differential display proteomics) – Η σύγκριση πρωτεωμάτων (π.χ. υγειών vs παθολογικών καταστάσεων), ποσοτικοποίηση και ανακάλυψη πρωτεϊνών με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης.
  • Πρωτεωμική χαρτογράφησης αλληλεπιδράσεων (Cell-mapping proteomics ή cataloging of protein-protein interactions) – Ταυτοποίηση πρωτεϊνικών συμπλόκων και των πρωτεϊνών που τα αποτελούν.

Μια ολοκληρωμένη πρωτεομική μελέτη για την αποσαφήνιση της λειτουργίας ενός άγνωστου γονιδίου και της πρωτεΐνης του μπορεί να περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια:

  • Συλλογή και επεξεργασία (διαχωρισμός κτλ.) του δείγματος.
  • Εύρεση της αμινοξικής ακολουθίας (μερικής ή ολικής).
  • Ταυτοποίηση των πρωτεϊνών και ποσοτικοποίηση.
  • Χαρτογράφηση των αλληλεπιδράσεων.

Συλλογή και επεξεργασία  του δείγματος

Τα  δείγματα μπορεί να προέρχονται από κύτταρα καλλιέργειας, ιστούς – βιοψίες, βιολογικά υγρά σώματος (π.χ. ορός, πλάσμα, ούρα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό).

Ένα από τα εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν  για τη μελέτη μιας πρωτεΐνης ή ομάδας πρωτεϊνών, είναι η εύρεσή της σε ικανοποιητική ποσότητα μέσα στο τελικό δείγμα. Μέσα σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο υπάρχουν πρωτεΐνες με ποσότητα από 10 αντίγραφα/κύτταρο (π.χ. μεταγραφικοί παράγοντες) μέχρι εκατοντάδες χιλιάδες αντίγραφα/κύτταρο. Έτσι, οι πρωτεΐνες που βρίσκονται σε μεγάλη ποσότητα θα επισκιάζουν τις υπόλοιπες. Για αυτό το λόγο, θα πρέπει οι προς μελέτη πρωτεΐνες να απομονώνονται. Αυτό γίνεται συνήθως με το συνδυασμό τεχνικών, όπως 1-D ηλεκτροφόρηση, 2-D ηλεκτροφόρηση, χρωματογραφία, χρήση αντισωμάτων, εμπλουτισμό του δείγματος ως προς μια ομάδα/κατηγορία πρωτεϊνών (π.χ. φωσφορυλιωμένες, μεμβρανικές, πυρηνικές) κ.α. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τη μείωση του ‘δυναμικού εύρους’ (dynamic range) του δείγματος.

Εύρεση  της αμινοξικής ακολουθίας

Η αποκωδικοποίηση του DNA έχει συμβάλλει στην δημιουργία τεράστιων βάσεων δεδομένων, οι οποίες είναι διαθέσιμες στο διαδίκτυο και αποτελούν σημαντικά εργαλεία για την πρωτεωμική. Η ακολουθία των αμινοξέων της πρωτεΐνης μπορεί να βρεθεί με τεχνικές όπως η αποδόμηση κατά Edman (Edman degradation), η οποία χρησιμοποιείται ελάχιστα πια, χαρτογράφηση πεπτιδίων (peptide mapping) ή αποτύπωμα πεπτιδικών μαζών (peptide mass fingerprinting) και διαδοχική φασματομετρία μαζών MS/MS (mass spectrometry – MS).

Η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών και  των αλληλεπιδράσεών τους γίνεται  με διάφορους τρόπους, ανάλογα με την τεχνική που χρησιμοποιείται. Θα επακολουθήσει περιγραφή της φασματομετρίας μάζας, με τέτοιο τρόπο ώστε (ελπίζουμε) να γίνει κατανοητή από όλους.

Βιβλιογραφία

Eisenberg, D., Marcotte, E.M., Xenarios, I., Yeates, T.O. (2000) Protein function in the post genomic era. Nature. 405: 823-826.
Fiers W. et al. (1976). Complete nucleotide-sequence of bacteriophage MS2-RNA – primary and secondary structure of replicase gene. Nature, 260: 500–507.
Gygi, S.P., Rochon, Y., Franza, B.R., Aebersold, R. (1999) Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Molecular and Cellular Biology. 19: 1720-1730.
Simpson, R.J. (2003) Proteins and Proteomics: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.
Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A, Yan JX, Gooley AA, Wilkins MR, Duncan MW, Harris R, Williams KL, Humphery-Smith I. (1995). Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis, 7: 1090-94.
Chambers, G., Lawrie, L., Cash, P., Murray, G.I. (2000). Proteomics: a new approach to the study of disease. J. Pathol. 192: 280-288.
Patterson, S.D., Aebersold, R.H. (2003) Proteomics: the first decade and beyond. Nature Genetics, 33: 311-323.

Share this...
Share on Facebook
Facebook
Email this to someone
email

Leave a comment!

Add your comment below, or trackback from your own site. You can also subscribe to these comments via RSS.

Be nice. Keep it clean. Stay on topic. No spam.

You can use these tags:
<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

This is a Gravatar-enabled weblog. To get your own globally-recognized-avatar, please register at Gravatar.