Home » Εργαστήρια

Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών, “SDS PAGE” και “2D Ηλεκτροφόρηση” (παλιό υλικό)

Submitted by on June 5, 2009 – 9:34 am2 Comments
Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών, “SDS PAGE” και “2D Ηλεκτροφόρηση” (παλιό υλικό)

Την παρακάτω παρουσίαση μας την έστειλε ο Νίκος Παρίσης, Τ.Ι.Ε., MSc Βιοτεχνολογίας, Υποψήφιος διδάκτωρ Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας. Το κείμενο του συνοδεύεται και  από βίντεο τα οποία μπορείτε να τα δείτε στην ανάρτηση “Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών“, στην κατηγορία βιντεοθήκη.

Η ηλεκτροφόρηση είναι μια μέθοδος διαχωρισμού μορίων ή σωματιδίων με πολλές εφαρμογές στην μοριακή βιολογία, βιοχημεία, πρωτεϊνική χημεία, φαρμακολογία, εγκληματολογία κ.α. Χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό της καθαρότητας ενός δείγματος, ποιοτικό και ποσοτικό έλεγχο, προσδιορισμό μοριακού βάρους (Μ.Β.) ενώ ως δείγματα μπορεί να είναι οτιδήποτε μπορεί να κουβαλάει φορτίο – από ολόκληρα κύτταρα έως πρωτεΐνες, πεπτίδια, νουκλεϊκά οξέα (DNA, RNA), αμινοξέα, φαρμακευτικές ουσίες, οργανικά οξέα και βάσεις και πολλά άλλα.

Η βασική αρχή στηρίζεται στο φαινόμενο κατά το οποίο φορτισμένα μόρια και σωματίδια, μέσα σε υδάτινα διαλύματα και κάτω από την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου, κινούνται προς την κατεύθυνση του ηλεκτροδίου με το αντίθετο φορτίο. Λόγω των διαφορετικών φορτίων και μαζών, τα διάφορα μόρια θα κινηθούν με διαφορετικές ταχύτητες (κινητικότητα). Η κινητικότητα αυτή εξαρτάται από την σταθερά pK και το μοριακό βάρος του φορτισμένου σωματιδίου ενώ άλλοι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την κινητικότητα είναι το pH και η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος (buffer), η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, η θερμοκρασία καθώς και η φύση του υλικού μέσα στο οποίο γίνεται η .

Υπάρχουν 3 κύριες ηλεκτροφορητικές μέθοδοι:

  1. Ηλεκτροφόρηση (zone electrophoresis – ZE)
  2. Ισοταχής ηλεκτροφόρηση (Isotachophoresis – ITP)
  3. Ισοηλεκτρικός εστιασμός (Isoelectric focusing – IEF)

Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει σε χαρτί, φιλμ και πηκτές (gels). Οι πιο γνωστές είναι η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών και DNA σε πηκτές ακρυλαμίδης και αγαρόζης, αντίστοιχα. Παρακάτω θα ακολουθήσει η περιγραφή της ποιο ευρέως χρησιμοποιούμενης ηλεκτροφορητικής μεθόδου πρωτεϊνών, της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμίδης με χρήση SDS (SDS-PAGE) και της ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων (2-D electrophoresis).

Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Είναι η πιο αξιόπιστη μέθοδος για τον διαχωρισμό και ανάλυση πρωτεϊνικών δειγμάτων ενώ παράλληλα συνδυάζεται εύκολα και αποτελεσματικά με άλλες μεθόδους (π.χ. western blotting, IEF, mass spectrometry).

Οι πηκτές πολυακριλαμίδης είναι χημικά αδρανής και διάφανες με πόρους που δημιουργούνται από τον πολυμερισμό των μονομερών ακρυλαμίδης με το αντιδραστήριο N,N’-methylenebisacrylamide. Το μίγμα (ακρυλαμίδης, Tris-HCl, SDS, APS, TEMED) χύνεται μέσα σε καλούπια και οι πηκτές μπορούν να είναι είτε κυλινδρικές (μέσα σε κυλινδρικούς γυάλινους σωλήνες) ή επίπεδες (ανάμεσα σε 2 επίπεδα γυαλιά με σφραγισμένα τα πλαϊνά άκρα τους) ενώ τα δείγματα τοποθετούνται σε οπές (wells) στο πάνω μέρος της πηκτής.

Γενικά, στην PAGE οι πηκτές μπορούν να κατασκευαστούν με σταθερή συγκέντρωση πολυακρυλαμίδης και buffer (continuous buffer systems) ή με τη δημιουργία ενός ‘συγκεντρωτικού΄ gel (stacking gel) ακριβώς πάνω από το ‘αναλυτικό’ gel (resolving gel) (discontinuous buffer systems). Το stacking gel έχει μικρότερη συγκέντρωση πολυακρυλαμίδης και συνεπώς μεγαλύτερους πόρους από το resolving (ή separation ή running) gel, στο οποίο γίνεται και ο διαχωρισμός του δείγματος. Οι δυο αυτοί παράμετροι, δηλαδή η διαφορετική συγκέντρωση πολυακρυλαμίδης και buffer επιτρέπει δείγματα με μεγάλους όγκους να συγκεντρωθούν στην πρώτη πηκτή (stacking gel) πριν εισέλθουν στη δεύτερη πηκτή όπου και θα διαχωριστούν. Αυτό βελτιώνει κατά πολύ την ανάλυση καθώς όλο το δείγμα ξεκινάει να αναλύεται απο το ίδιο σημείο. Αντίθετα, τα συστήματα με σταθερή συγκέντρωση πολυακρυλαμίδης και buffer επιβάλλουν τη συγκέντρωση του δειγματος σε πολύ μικρό όγκο.

Το 1970, ο Laemmli, εισήγαγε ένα σύστημα (Tris-glycine-SDS system) το οποίο χρησιμοποιείται περισσότερο στις μέρες μας. Στο σύστημα αυτό, το stacking gel έχει pH 6,8 και το δείγμα ‘παγιδεύεται’ ανάμεσα σε ιόντα Cl-, τα οποία προηγούνται, και μόρια γλυκίνης, τα οποία ακολουθούν, και έτσι το δείγμα σχηματίζει μια λεπτή μπάντα (band), σύμφωνα με τις αρχές της ισοταχής ηλεκτροφόρησης. Αυτό συμβαίνει διότι η γλυκίνη είναι διπολικό ιόν σε αυτό το περιβάλλον, καθώς η τιμή pKa της γλυκίνης είναι αρκετά υψηλότερη απο το pH του gel, και έτσι η κινητικότητα των μορίων της είναι πολύ χαμηλή. Τα ιόντα χλωρίου έχουν υψηλότερη κινητικότητα και προηγούνται αλλά δε μπορούν να απομακρυνθούν καθώς αφήνουν πίσω τους θετικά ιόντα δημιουργώντας μια διαφορά δυναμικού κρατώντας τα σε κοντινή απόσταση. Έτσι σχηματίζεται μια ‘ζώνη’ μέσα στην οποία βρίσκεται ‘παγιδευμένο’ το δείγμα. Με λίγα λόγια, η κινητικότητες των μορίων εξαρτώνται αποκλειστικά από το καθαρό τους φορτίο και όχι από το μέγεθος τους διότι οι πόροι της πηκτής είναι αρκετά μεγάλοι. Το φαινόμενο αυτό στηρίζεται στο λεγόμενο Kohlrausch boundary (τα πρώτα 7 δευτερόλεπτα από το βίντεο 2). Όταν η ‘ζώνη’ αυτή εισέλθει στο resolving gel, το οποίο έχει pH 8,8 και μικρότερους πόρους, η κινητικότητα του δείγματος μειώνεται και αυτή των μορίων της γλυκίνης αυξάνεται κατά πολύ, καθώς ιοντίζονται, και προσπερνάνε τα μόρια του δείγματος. Από το σημείο αυτό (σταθερό pH και δυναμικό) ξεκινάει ο διαχωρισμός των μορίων του δείγματος. Όλη η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης γίνεται μέσα σε buffer (Tris-Glycine-SDS) με pH περίπου 8,3.

Ένα άλλο πλεονέκτημα του συστήματος Laemmli, είναι η χρήση του sodium dodecyl sulfate (SDS). Το SDS είναι ένα ισχυρό ανιονικό απορρυπαντικό, το οποίο δεσμεύεται με τις πρωτεΐνες (1,4g ανά g πρωτεΐνης). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αποδιάταξη της τεταρτοταγούς και δευτεροταγούς δομής και την πρόσδοση αρνητικού φορτίου σε όλες τις πρωτεΐνες. Το τελευταίο εξαλείφει την επιρροή του φορτίου στην κινητικότητα και οι πρωτεΐνες κινούνται μόνο με βάση το Μ.Β. τους (Εικόνα 1). Επίσης, γίνεται δυνατή η ανάλυση όλων των πρωτεϊνών του δείγματος καθώς τώρα θα κινηθούν όλες προς το ίδιο ηλεκτρόδιο (άνοδο) ενώ διαφορετικά οι πρωτεΐνες με ισοηλεκτρικά σημεία (pI) μεγαλύτερα του 6,8 θα μετακινούνταν προς την κάθοδο και θα χάνονταν.

Εικόνα 1: Απεικόνιση gel με Coomasie Blue. Τα δείγματα (1-9) τοποθετήθηκαν στο πάνω μέρος του gel και αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Η πρώτη και προτελευταία στήλη περιέχουν μίγμα πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους που χρησιμοποιούνται ως δείκτες. Η ένταση του χρώματος είναι ενδεικτικό της συγκέντρωσης. Η εικόνα πάρθηκε από τη σελίδα της Abcam (link).

Προετοιμασία του δείγματος

Η προετοιμασία του δείγματος είναι πολύ σημαντική και από μόνη της μπορεί να κρίνει την επιτυχία της ηλεκτροφόρησης. Αρχικά, το buffer στο οποίο βρίσκεται το δείγμα θα πρέπει να αντικατασταθεί με το Laemmli buffer, το οποίο περιέχει:

  • SDS – εκτός απο τα ήδη προαναφερθέντα, η χρήση του εκμηδενίζει τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και την δημιουργία συμπλόκων.
  • Γλυκερόλη – είναι παχύρρευστο υγρό και βοηθάει το δείγμα να βυθιστεί στον πάτο της οπής του gel.
  • Tris – είναι μια οργανική ουσία και προσδίδει το κατάλληλο pH (6,8) για τη διατήρηση των πρωτεϊνών.
  • Dithiothreitol (DTT) ή 2-mercaptoethanol – είναι αναγωγικές ουσίες και διασπάνε τους δισουλφιδικούς δεσμούς ανάμεσα στις κυστεΐνες των πρωτεϊνών και συμβάλουν στην πλήρη μετουσίωσή τους. Η παρουσία τους στο buffer δεν είναι πάντοτε επιθυμητή, ειδικά όταν δεν χρειάζεται η πλήρης μετουσίωση των πρωτεϊνών π.χ. στην περίπτωση ορού αίματος και την διατήρηση της τεταρτοταγούς δομής των ανοσοσφαιρινών.
  • μπλε βρωμοφαινόλη – είναι χρωστική με αρνητικά φορτισμένα μόρια (άρα θα μετακινηθεί προς την άνοδο) και χρησιμοποιείται ως ένδειξη για την πορεία της ηλεκτροφόρησης.

Στη συνέχεια το δείγμα είτε θερμαίνεται στους 90-100οC για μερικά λεπτά, ώστε το SDS να δεθεί με τις πρωτεΐνες και να δράσει η αναγωγική ουσία (εφόσον έχει προστεθεί στο buffer) ή αφήνεται σε θερμοκρασια δωματίου για 30 λεπτά. Τέλος, το δείγμα φυγοκεντρείται ώστε να απομακρυνθούν οι αδιάλυτες ουσίες (καθώς επηρρεάζουν αρνητικά την ανάλυση).

– – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – –

2-D ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

Η χρήση δύο ανεξάρτητων ηλεκτροφορετικών μεθόδων έχει αυξήσει κατά πολύ την δυνατότητα ανάλυσης των πρωτεϊνών. Ο πιο κλασικός συνδυασμός είναι του ισοηλεκτρικού εστιασμού (IEF) και της SDS- PAGE.

Αρχικά, στην πρώτη διάσταση, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση το ισοηλεκτρικό τους σημείο (pI) ενώ στην δεύτερη, διαχωρίζονται με βάση το Μ.Β. Το αποτέλεσμα τώρα δεν είναι μια σειρά από μπάντες αλλά βούλες ή κηλίδες (spots) διασκορπισμένες στο gel, με την κάθε μία να αντιπροσωπεύει μια πρωτεΐνη. Αυτού του τύπου ο διαχωρισμός, παρέχει την καλύτερη ποιότητα ανάλυσης μέχρι σήμερα.

Ο IEF μπορεί να εφαρμοστεί σε μόρια τα οποία μπορούν να είναι είτε θετικά ή αρνητικά φορτισμένα. Τέτοια μπορεί να είναι οι πρωτεΐνες, πεπτίδια και ένζυμα. Το καθαρό φορτίο μιας πρωτεΐνης είναι το άθροισμα όλων των φορτίων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, αλλά η τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης, οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις έχουν και αυτές σημαντικό ρόλο. Για τον διαχωρισμό, χρησιμοποιούνται ειδικές ταινίες (strips) με πολύ λεπτά gel αγαρόζης ή κυρίως πολυακρυλαμίδης με βαθμωτό pH. Η κλίμακα του pH μπορεί κυμαίνεται απο 3-9 ενώ στο εμπόριο κυκλοφορούν ταινίες με ποικιλία στην κλιμάκωση του pH (3-5, 5-7 κτλ.) για την καλύτερη ανάλυση συγκεκριμένων ομάδων πρωτεϊνών. Η δημιουργία των βαθμίδων του pH και η ικανότητα αξιόπιστης αναπαραγωγής των πειραμάτων ήταν πάντα ένα σημαντικό ζήτημα για τους επιστήμονες. Χωρίς να εμβαθύνουμε με κουραστικές πληροφορίες, απλά να αναφερθεί ότι η χρήση ασθενών οξέων και βάσεων, που ονομάζονται Immobilines (ακινητοποιητές), έχουν εξαλείψει αρκετούς από τους περιορισμούς που υπήρχαν αρχικά στη σταθερότητα της βαθμωτής κλίμακας του pH. Τελικά, εφόσον ολοκληρωθεί ο IEF, οι διαχωρισμένες (κατα pI) πρωτεΐνες, διαχωρίζονται περαιτέρω με PAGE με βάση το Μ.Β.

H 2D ηλεκτροφόρηση, αν και είναι δύσκολη στη χρήση της και απαιτείται μεγάλη ποσότητα δείγματος, χρησιμοποιείται συνεχώς στον κλάδο της Πρωτεομικής, με σκοπό την σύγκριση ολόκληρων πρωτεομάτων και την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που συμβάλλουν στην διάγνωση, πορεία και θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Θεωρείται η τεχνική που παρέχει την καλύτερη ανάλυση στις μέρες μας, παρόλο το γεγονός ότι ένας αριθμός πρωτεϊνών χάνεται (αυτές με pI <3 και >9).

Εικόνα 2: 2D ηλεκτροφόρηση (πηγή: link).

Προετοιμασία του δείγματος

Είναι και αυτή πολύ σημαντική για την επιτυχία του πειράματος και πρέπει να αντιμετωπιστούν αρκετές δυσκολίες. Η μεγαλύτερη πρόκληση είναι η διαλυτότητα του δείγματος καθώς όλες οι πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένου και των υδρόφοβων, θα πρεπει να βρίσκονται σε διάλυμα. Παράλληλα, τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα θα πρέπει να έχουν διασπαστεί, και να μην υπάρχουν άλατα, λιπίδια ή φαινόλες. Τα περισσότερα προβλήματα φαίνεται να έχουν εξαλειφθεί με τη χρήση της ουρίας και του απορρυπαντικού CHAPS (ή άλλων πιο ήπιων του SDS π.χ. Triton X-100, NP-40).

Απεικόνιση Πρωτεϊνών

Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες δεν φαίνονται και το αποτέλεσμα είναι ένα διάφανο gel, όπως ακριβώς και ένα ‘αδειο’ gel. Η απεικόνιση των πρωτεϊνών επιτρέπεται με τη χρήση διαφόρων χρωστικών, οι οποίες δίνουν την δυνατότητα ανίχνευσης από 2-300 ng πρωτεΐνης. Η επιλογή της κατάλληλης χρωστικής εξαρτάται από την ευαισθησία που απαιτείται αλλα κυρίως από την συμβατότητα της χρωστικής με τεχνικές που θα ακολουθήσουν την ηλεκτροφόρηση. Από αυτές, μερικά παραδείγματα είναι:

  • Coomassie Brilliant Blue – ευαισθησία έως 30 ng.
  • Colloidal Coomassie Blue – ευαισθησία έως 10 ng.
  • Zinc-imidazole – ευαισθησία έως 2 ng.
  • Silver stain – ευαισθησία έως 2 ng.
  • SYPRO Ruby – ευαισθησία έως 1 ng.

Βιβλιογραφία

Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227(5259), 680-685.
Simpson, R.J. (2003) Proteins and Proteomics: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.
Westermeier, R. (1997) Electrophoresis in practice. 2nd edition. Weinheim, Germany.

Share this...
Share on Facebook
Facebook
Email this to someone
email

2 Comments »

  • Κωνσταντίνα says:

    Καλησπέρα,
    Θα ήθελα να ρωτήσω πως βρίσκω την ποσότητα της άγνωστης πρωτεϊνης που φορτώνω στο τζελ. Δηλαδή πως βρίσκω πόσα μl δείγματος, πόσα νερού και πόσα SDS θα προσθέσω σε πηγαδάκια που χωρούν 35μl? Έστω ότι θέλω να φορτώσω 30,20 και 15μgr άγνωστης πρωτείνης από δείγμα που την περιέχει σε συγκέντρωση 400μgr/ml? Πώς το βρίσκω?
    Ευχαριστώ εκ των προτέρων.

  • Nikos says:

    Γεια σου Κωνσταντίνα,
    Πρώτα απ’όλα, δεν φορτώνεις ξεχωριστά το δείγμα, ξεχωριστά το νερό, το SDS κτλ. Αλλά το δείγμα σου με τις πρωτεΐνες είναι διαλυμένο στο ρυθμιστικό διάλυμα Laemmli.

    Πάμε στο παράδειγμά σου (υποθέτω ότι το δείγμα σου περιέχει μόνο αυτή την πρωτεΐνη καθαρή). Σε τι ρυθμιστικό διάλυμα;
    -- Αν βρίσκεται ήδη στο Laemmli, δεν χρειάζεται να κάνεις τίποτα άλλο πέρα από υπολογισμούς.
    Δηλαδή --> (ένας απλός τρόπος) έχεις 400μgr σε 1ml δηλ. 400μgr σε 1000μl. Άρα σε 1μl έχεις 0.4μgr (τα διαιρώ και τα 2 με το 1000). Και μετά παίζεις με πολλαπλάσια αυτού. Δηλ. σε 10μl έχεις 4μgr, σε 20μl έχεις 8μgr, σε 30 έχεις 12μgr.
    (ένας άλλος εύκολος τρόπος: η μέθοδος των τριών [http://egpaid.blogspot.com/2010/02/blog-post_6733.html]) Δηλ.
    Έχω 400μgr σε 1000μl
    15μgr σε πόσα μl έχω;
    Λύνεις ως προς Χ και έχεις: 15*1000/400=37,5μl
    Το ίδιο κάνεις και με τις υπόλοιπες ποσότητες.

    Όπως βλέπεις για να φορτώσεις τις ποσότητες που θέλεις, χρειάζεσαι παραπάνω από την χωρητικότητα του πηγαδιού (35μl). Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει ή να χρησιμοποιήσεις μεγαλύτερη οπή στο gel ή να συγκεντρώσεις το δείγμα σου. Αυτό μπορεί να γίνει με διάφορες μεθόδους όπως 1. methanol/chloroform precipitation; 2. TCA precipitation και άλλες. Αυτές κατακρημνίζουν τις πρωτεΐνες (βρίσκονται ως ίζημα) στο δείγμα και στη συνέχεια διαλύονται εκ νέου σε μικρότερη ποσότητα διαλύματος, άρα αυξάνουμε τη συγκέντρωση.
    Αν το ερώτημά σου είναι πρακτικό, μπορούμε να το αναλύσουμε παραπάνω. Διαφορετικά, όλα τα παραπάνω αρκούν.

    -Αν το δείγμα σου ΔΕΝ είναι σε Laemmli, θα πρέπει να χρησιμοποιήσεις συμπηκνωμένο Laemmli (π.χ. 5x = 5 φορές συμπηκνωμένο) και να το προσθέσεις στο δείγμα σου σε αναλογία δείγμα/Laemmli 5/1. Δηλαδή σε π.χ. 400μl δείγμα να προσθέσεις 100μl Laemmli.
    Αυτό φυσικά συνεπάγεται θα διαλύσεις κι άλλο το δείγμα σου. Άρα πρώτα υπολογίζεις την καινούρια συγκέντρωση και μετά κάνεις ότι είπαμε παραπάνω.

    Ελπίζω να σε βοήθησα, αν χρειάζεσαι κάτι παραπάνω, μη διστάσεις να ρωτήσεις.
    Νίκος

Leave a comment!

Add your comment below, or trackback from your own site. You can also subscribe to these comments via RSS.

Be nice. Keep it clean. Stay on topic. No spam.

You can use these tags:
<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

This is a Gravatar-enabled weblog. To get your own globally-recognized-avatar, please register at Gravatar.